TUGAS JAMUR BERMANFAAT:
ANALISIS PROTEOMIK Verticillium albo-atrum
PENDAHULUAN
Layu verticillium adalah penyakit vaskuler yang disebabkan oleh patogen tular tanah (soil born disease) jamur Verticillium albo-atrum dan Verticillium dahliae. Isolat V. albo atrum memiliki kemampuan menginfeksi dan menyebar yang berbeda-beda sesuai dengan tingkat virulensinya, dengan menghasilkan gejala yang ringan atau yang mematikan. Isolat-isolat tersebut dibedakan dengan mengunakan PG1 (untuk gejala yang ringan) atau PG2 (untuk gejala yang mematikan) untuk setiap tipe patogen (pathotype), hal ini didasarkan atas tes patogenesitas dan analisis AFLP. Penyebaran gejala mematikan di taman Savinja valley adalah ancaman serius terhadap produksi. Dari tahun 1997 hingga 2006, lebih dari 180 ha taman telah terinfeksi dan 90 ha hancur. Hal ini disebabkan oleh tidak efektifnya agen phytopharmaceutical, yang hanya efektif melawan penyakit dalam kondisi yang bersih dan ukuran yang higinis, saat rotasi tanaman, dan penanaman varietas tahan. Kami menggunakan pendekatan proteomik untuk mendapatkan informasi yang lebih banyak mengenai proses infeksi dan untuk mengidentifikasi hubungan protein terhadap infeksi. Analisis simultan dari total protein pada dua dimensi gel poliakrilamida.
PENDAHULUAN
Layu verticillium adalah penyakit vaskuler yang disebabkan oleh patogen tular tanah (soil born disease) jamur Verticillium albo-atrum dan Verticillium dahliae. Isolat V. albo atrum memiliki kemampuan menginfeksi dan menyebar yang berbeda-beda sesuai dengan tingkat virulensinya, dengan menghasilkan gejala yang ringan atau yang mematikan. Isolat-isolat tersebut dibedakan dengan mengunakan PG1 (untuk gejala yang ringan) atau PG2 (untuk gejala yang mematikan) untuk setiap tipe patogen (pathotype), hal ini didasarkan atas tes patogenesitas dan analisis AFLP. Penyebaran gejala mematikan di taman Savinja valley adalah ancaman serius terhadap produksi. Dari tahun 1997 hingga 2006, lebih dari 180 ha taman telah terinfeksi dan 90 ha hancur. Hal ini disebabkan oleh tidak efektifnya agen phytopharmaceutical, yang hanya efektif melawan penyakit dalam kondisi yang bersih dan ukuran yang higinis, saat rotasi tanaman, dan penanaman varietas tahan. Kami menggunakan pendekatan proteomik untuk mendapatkan informasi yang lebih banyak mengenai proses infeksi dan untuk mengidentifikasi hubungan protein terhadap infeksi. Analisis simultan dari total protein pada dua dimensi gel poliakrilamida.
Gambar 1. Miselium Verticillium albo-atrum
Gambar 2. Gejala layu Verticillium pada tanaman, jaringan vaskuler menjadi coklat(kiri), kemudian layu diseluruh bagian tanaman (kanan)
BAHAN DAN METODE
Verticillium albo-atrum ditumbuhkan dalam media jamur selama satu minggu dan miselium didapatkan melalui filtrasi. Protein diekstrasi berdasarkan metode Jamnik et al. dan konsentrasinya diukur dengan menggunakan reagen bradford. 450µg protein dipercepat, dengan diperlakukan dalam larutan rehidrasi dan diaplikasikan pada 13 cm IPG strips (pH 4-7) dengan proses rehidrasi. Setelah pemfokusan isoelektrik, strips diequalibrasikan dan diproses pada 12,5 % gel poliakrilamida. Setelah elektroforesis, gel diwarnai dengan coomassie briliant blue G-250. hal ini berdasarkan metode Neuhoff et al yang kemudian dipindai. Software dua dimensi digunakan untuk analisis gambar dan tes statistik. Empat teknik biologis dan tiga teknik replikasi dimasukkan dalam metode penelitian (untuk total 24 gel).
Verticillium albo-atrum ditumbuhkan dalam media jamur selama satu minggu dan miselium didapatkan melalui filtrasi. Protein diekstrasi berdasarkan metode Jamnik et al. dan konsentrasinya diukur dengan menggunakan reagen bradford. 450µg protein dipercepat, dengan diperlakukan dalam larutan rehidrasi dan diaplikasikan pada 13 cm IPG strips (pH 4-7) dengan proses rehidrasi. Setelah pemfokusan isoelektrik, strips diequalibrasikan dan diproses pada 12,5 % gel poliakrilamida. Setelah elektroforesis, gel diwarnai dengan coomassie briliant blue G-250. hal ini berdasarkan metode Neuhoff et al yang kemudian dipindai. Software dua dimensi digunakan untuk analisis gambar dan tes statistik. Empat teknik biologis dan tiga teknik replikasi dimasukkan dalam metode penelitian (untuk total 24 gel).
HASIL
Pemisahan protein berjalan dengan baik dan hanya terdapat beberapa spot dengan garis horizontal dan melintang. Kemampuan teknik-teknik replikasi diterapkan dengan sangat baik, sementara itu juga teknik biologis menunjukkan perbedaan yang minim. Rata-rata, 2645 terdeteksi oleh PG1 (660 valid) dan 2529 spot terdeteksi oleh PG2 (721 valid). Sebuah spot dikatakan valid jika spot ini menunjukkan setidaknya 9 replikasi gel (lebih dari 12) dan jika spot dapat melewati penyaringan kriteria. Terdapat 173 spot yang hanya ditunjukkan oleh PG1 pathotype dan 234 spot hanya ditemukan pada PG2 pathotype; 487 spot diobservasi dan ditemukan di kedua pathoptype. Faktor yang mempengaruhi dalam penelitian ini telah dipersiapkan, yang mana telah dihasilkan 64 spot yang secara signifikan lebih banyak terdapat pada PG1 pathotype dan 90 spot secara signifikan lebih banyak terdapat pada PG2 pethotype (p<0,05).>
Pemisahan protein berjalan dengan baik dan hanya terdapat beberapa spot dengan garis horizontal dan melintang. Kemampuan teknik-teknik replikasi diterapkan dengan sangat baik, sementara itu juga teknik biologis menunjukkan perbedaan yang minim. Rata-rata, 2645 terdeteksi oleh PG1 (660 valid) dan 2529 spot terdeteksi oleh PG2 (721 valid). Sebuah spot dikatakan valid jika spot ini menunjukkan setidaknya 9 replikasi gel (lebih dari 12) dan jika spot dapat melewati penyaringan kriteria. Terdapat 173 spot yang hanya ditunjukkan oleh PG1 pathotype dan 234 spot hanya ditemukan pada PG2 pathotype; 487 spot diobservasi dan ditemukan di kedua pathoptype. Faktor yang mempengaruhi dalam penelitian ini telah dipersiapkan, yang mana telah dihasilkan 64 spot yang secara signifikan lebih banyak terdapat pada PG1 pathotype dan 90 spot secara signifikan lebih banyak terdapat pada PG2 pethotype (p<0,05).>
Gambar 3. Representatif gambar 2-D Gels: PG1 (atas) dan PG2 (bawah). Spot yang dipilih untuk analisis MS ditandai dengan panah
KESIMPULAN
Elektroforesis dua dimensi suskes digunakan untuk memisahkan protein seluler dari Verticllium albo-atrum. Perbedaan signifikan antara PG1 dan PG2 pathotype telah diobservasi dan akan diinvestigasi lebih lanjut. Selanjutnya, media jamur yang umum dipakai akan diganti dengan medium simulated xylem fluid untuk menunjukkan ekspresi gen yang berhubungan langsung dengan ekspresi.
DAFTAR PUSTAKA
Radisek S., Jakse J., Simon& A., lavornik B., 2003. Characterization of Verticillium albo-atrum field isolates using pathogenicity data and AFLP analysis. Plant Disease 87: 633-638
Radigek S., 2006. Hmeljeva uvelost v slovenskih hmeljiscih. Ingtitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije
Jamnik P., Radisek S., Javornik B., Raspor P., 2006. 2-D separation of Verticillium albo-atrum proteins. Acta agriculturae Slovenica 87-2: 455-460
Neuhoff V., Stamm R., Eibl H., 1985. Clear background and highly sensitive protein staining with Coomassie Blue dyes in polyacrylamide gels: A systematic analysis. Electrophoresis 6*. 427-448
Radisek S., Jakse J., Simon& A., lavornik B., 2003. Characterization of Verticillium albo-atrum field isolates using pathogenicity data and AFLP analysis. Plant Disease 87: 633-638
Radigek S., 2006. Hmeljeva uvelost v slovenskih hmeljiscih. Ingtitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije
Jamnik P., Radisek S., Javornik B., Raspor P., 2006. 2-D separation of Verticillium albo-atrum proteins. Acta agriculturae Slovenica 87-2: 455-460
Neuhoff V., Stamm R., Eibl H., 1985. Clear background and highly sensitive protein staining with Coomassie Blue dyes in polyacrylamide gels: A systematic analysis. Electrophoresis 6*. 427-448
Cukup bagus. Reviewnya mana? Beritahukan yg lain kalo soal UAS epi sdh bisa di download.
BalasHapus